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Western Blot-ECL特超敏发光液
Femto ECL
Femto ECL
- 产品描述
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Femto ECL 化学发光底物 说明书
产品规格：100ml 500ml
保存：室温运输，收到后在4℃避光下储存试剂
Femto ECL是一款具有特超高灵敏度的增强型化学发光(ECL)底物，也是富百科的最高灵敏度的化学发光底物，可通过辣根过氧化物酶(HRP)实现低飞克级的免疫印迹检测。由于采用了富百科独有的核心专利技术基于“乒乓”机理设计的发光底物系统。可通HRP实现实现低飞克级的免疫印迹检测，其灵敏度，发光时间和背景均明显优于T公司和M公司。
产品简介
FemtoECL特超高灵敏度底物是用于辣根过氧化物酶(HRP)的增强型化学发光底物，有以下特点：
• 灵敏—使用适当的一抗和二抗时，可在硝化纤维膜或PVDF膜上检测丰度为飞克级的蛋白条带
• 定量—所得信号的可定量检测范围跨越两个数量级
• 明亮信号—通过胶片或成像系统进行曝光，易于捕获图像
• 长信号持续时间—优化条件下，可检测的光信号输出长达8小时
• 稳定试剂—试剂盒组分能够在4°C条件下稳定放置一年，在室温下可稳定放置6个月
• 价格经济— 配方经过优化，可适用于浓度极低的抗体检测
• 1ng至0.2 µg/mL一抗（以1 µg/mL储存液稀释1:5,000至1:100,000倍）
• 2ng至10 ng/mL二抗（以1 µg/mL储存液稀释1:100,000至1:500,000倍）
当Femto ECL底物与优化的抗体浓度和封闭缓冲液配合使用时，可检测到常规ECL底物无法检测的低丰度靶标蛋白。
重要提示:
重要提示:
Ø 为获得最佳效果，必须优化该系统的全部组分，包括样品量、一抗和二抗浓度以及膜和封闭试剂的类型。
Ø 使用该产品比使用沉淀比色HRP底物检测所需的抗体浓度低。为优化抗体浓度，请进行一次系统的点印迹分析。
Ø 没有一种封闭试剂对所有系统而言都是最佳的，所以为每一个免疫印迹检测系统找到最合适的封闭缓冲液非常必需。封闭试剂有可能与抗体产生交叉反应，导致出现非特异性信号。封闭缓冲液同时也会影响系统的灵敏性。当从一种底物转换为另一种底物时，有时会出现信号衰减或背景增加的现象，原因可能是封闭缓冲液不适合新的检测系统。
Ø 使用亲和素/生物素检测系统时，避免使用牛奶作为封闭试剂，因为牛奶中含有不定量的内源性生物素，会导致高背景信号。
Ø 保证洗涤缓冲液、封闭缓冲液、抗体溶液和底物工作液的使用体积，以确保在整个实验过程中印迹膜完全被液体覆盖，避免膜变干。增大封闭缓冲液及洗涤缓冲液的使用量可以降低非特异性的信号
Ø 为获得最佳效果，在孵育步骤请使用摇床。
Ø 将Tween20(终浓度0.05-0.1%)加入封闭缓冲液和稀释的抗体溶液，以降低非特异信号。使用高品质的产品，如去污剂。它保存在安瓿中，过氧化物和其他杂质含量很低。
Ø 不要使用叠氮钠作为缓冲液的防腐剂。叠氮钠是HRP的抑制物
Ø 避免手与膜直接接触，实验过程应戴手套或使用干净的镊子
Ø 所有设备必须清洁且不沾染外来物质。金属器械（如剪刀）不得具有可见的锈迹。锈迹可能导致斑点形成和高背景。
Ø 底物工作液在室温下可稳定8小时。日光或任何其他强光下可能损害底物，为获得最佳结果，将底物工作液保存在琥珀色瓶中，并避免长期暴漏在任何强光下，短时间暴漏于实验室常规照明不会损害该工作液
操作概述
常见问题及解决方案
操作概述
注：优化抗原和抗体的浓度。必须使用建议的抗体稀释度，以保证阳性结果。有关建议的稀释度范围请参考其他所需材料。
1) 将一抗浓度稀释到1ng至0.2 ng/mL（以1 µg/mL储存液稀释1:5,000至1:100,000倍）
2) 将二抗浓度稀释到2ng至10 ng/mL（以1 µg/mL储存液稀释1:100,000至1:500,000倍）
3) 将两种底物组份按1:1比例混合，制备底物工作液。
注：暴漏于日光或任何其他强光可能损害工作液，为获得最佳结果，将此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免长期暴漏于任何强光。短时间暴漏于实验室常规照明不会损害该工作液。
4) 将印迹膜在 Femto ECL底物工作液中孵育5分钟。
5) 吸出多余试剂。用清洁的塑料膜盖住该印迹膜。
6) 使印迹膜在X光胶片上曝光。
其他所需材料
其他所需材料
l 已完成转印的印迹膜：用合适的电泳法分离蛋白质，并将这些蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
l 稀释缓冲液：使用Tris或磷酸盐缓冲液。
l 洗涤缓冲液：将5mL 10%的Tween-20加入1000mL稀释缓冲液（Tween-20的终浓度将0.05%）。
l 封闭试剂：将0.5mL10%的Tween-20加入100mL的封闭缓冲液，选择一种与稀释缓冲液具有相同基本组分的封闭缓冲液。
l 一抗： 选择一种目标蛋白质特异性抗体。使用稀释缓冲液制备该抗体的储存液。使用封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体工作液。最佳稀释度取决于一抗和膜上的抗原量。
l HRP标记的二抗：选择一种与二抗特异性结合的HRP标记二抗，使用稀释缓冲液制备该抗体的储存液。使用封闭试剂将抗体从储备液稀释成抗体工作液。稀释度介于1:100000和1:500000之间或抗体工作液浓度为2～10ng/ml。该浓度范围在使用链亲和素-HRP时也适用。二抗的最佳稀释度取决于HRP标记二抗和膜上的抗原量。
l 用于处理放射显影胶片的胶片暗盒、显影和定影试剂
l 用于孵育的旋转摇床。
蛋白印迹法详细操作步骤
蛋白印迹法详细操作步骤
1) 将印记膜从蛋白转印设备中取出，加入合适的封闭液在温室下孵育20-60分钟，同时振荡。以封闭膜上非特异性蛋白结合位点。请注意：使用在前文建议的抗体稀释度是非常重要的。
2) 将膜从封闭液中取出，与一抗工作液在温室孵育1小时，同时振荡；或在28℃孵育过夜，不振荡。
3) 将足量的洗涤缓冲液加至膜上，保证缓冲液将膜完全覆盖。振荡孵育≥5分钟，更换洗涤缓冲液并重复该步骤4-6次。增加洗涤缓冲液体积，洗涤次数和洗涤时间有助于降低背景信号。
注：孵育前，膜在洗涤缓冲液中的短暂淋洗会提高洗涤效率。
请注意：使用在前文建议的HRP标记二抗稀释度是非常重要的。
4) 将HRP标记的二抗工作液与膜在温室孵育1小时，同时振荡。
5) 重复步骤3，以除去未结合的HRP标记二抗。注：膜与HRP标记二抗孵育后必须进行彻底洗涤。
6) 将A溶液与B液等比例混合，制备成工作液。每cm2膜使用0.01～0.1ml工作液。工作液可以在温室下稳定8小时。注：暴漏雨日光或任何其他强光下可能损害工作液，为获得最佳结果，将此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免长期暴漏雨任何强光。实验室的常见照明不会损害工作液。
7) 将印记膜在工作液中孵育5分钟。
8) 从工作液中取出印记膜，并置于一个塑料片或清洁的塑料纸（膜）中，用一张吸水纸吸除多余的液体，并从印记和塑料纸之间小心地压出气泡。
9) 将包在塑料纸（膜）中的印记膜置于胶片暗盒中，蛋白质面朝上，除适用于胶片曝光的灯（如红色安全灯）之外，关闭所有的灯。
注;胶片必须在曝光期间保持干燥，为获得最佳效果，采取以下措施：
* 确保将多余的底物从膜和塑料纸上完全去除。
* 在整个胶片处理期间，使用手套。
* 切莫将印记膜置于已显影的胶片上，因为胶片上的化学物质会减弱信号。
10) 将X光胶片置于膜的上面。建议第一次曝光60秒。之后可调整曝光时间以达到最佳结果。化学发光反应在底物孵育后的前5-30分钟期间是最强烈的。这一反应可以持续几个小时，但强度会随时间下降，如有底物孵育后较长时间后曝光，曝光时间可能需要延长以获得较强信号。如果使用磷光存储成像设备（如Bio-Rad的分子成像仪系统）或CCD照相机可能需要较长的曝光时间。
警告：胶片与膜之间的任何移动可能在胶片上造成人为的非特异信号。
11) 使用合适的显影剂和定影剂对胶片进行显影。如果信号太强，则缩短曝光时间或将印记膜进行剥离并降低抗体浓度重新检测。
产品参数
产品参数
| Name | Femto ECL | ||
| CAT# | DIB051-100mL; DIB051-500mL | CAS# | N/A |
| Storage# | 4°C干燥避光 | Shelf Life# | 12个月 |
| Ex(nm)# | N/A | Em(nm)# | N/A |
| MW# | N/A | Solvent# | N/A |
常见问题及解决方案
| 问题 | 可能问题 | 解决方案 | |
| 胶片上有反转像（即黑色背景，白色带） | 系统中HRP过多 | 将HRP标记二抗稀释至少10倍 | |
| 膜上有褐色或黄色带 | |||
| 印记在暗室中发光 | |||
| 信号持续时间少于8小时 | |||
| 信号弱或无信号 | 系统中过多的HRP耗尽了底物并导致信号迅速衰减 | 将HRP标记二抗稀释至少10倍 | |
| 抗原或抗体的量不足 | 增加抗体或抗原的量 | ||
| 蛋白质转移率低 | 优化转印 | ||
| HRP或底物活性低 | 见下文注释 | ||
| 高背景 | 系统中HRP过多 | 将HRP标记二抗稀释至少10倍 | |
| 封闭不充分 | 优化封闭条件 | ||
| 封闭式机不合适 | 尝试一种不同的封闭试剂 | ||
| 洗涤不充分 | 增加洗涤时间、次数或洗涤缓冲液体积 | ||
| 胶片过度曝光 | 缩短曝光时间或使用背景消除剂 | ||
| 抗原或抗体的浓度太高 | 减少抗体或抗原的量 | ||
| 蛋白质条内有斑点 | 蛋白质转膜效率低 | 优化转印流程 | |
| 膜的水化不均匀 | 按照制造商建议适度的使膜水化 | ||
| 胶片与膜之间存在气泡 | 在胶片曝光前，去除气泡 | ||
| 胶片上背景有斑点 | HRP标记二抗中存在聚集物 | 使用0.2um的过滤器 | |
| 非特异性条带 | 系统中HRP过多 | 将HRP标记二抗稀释至少10倍。 | |
| SDS导致的蛋白非特异性结合 | 在检测过程中不使用SDS | ||
| 产品名称 | 检测浓度 | 推荐抗体孵育浓度（ng/mL） |
| ECL plus | 皮克级~10-12g | 一抗浓度：100～500 |
| 二抗浓度：10～50 | ||
| West Pico ECL | 小于皮克级<10-12g | 一抗浓度：100～500 |
| 二抗浓度：10～50 | ||
| West Femto ECL | 小于飞克级<10-15g | 一抗浓度：20～100 |
| 二抗浓度：4～20 | ||
| West Dura ECL | 小于飞克级<10-15g | 一抗浓度：2～100 |
| 二抗浓度：2～10 |
